膜蛋白幾乎在所有生理過程中都起著重要作用，這些作用包括但不限于細(xì)胞間接觸、表面識別、酶活性或跨膜運(yùn)輸?shù)取Ｄさ鞍鬃鳛樯锬すδ艿闹饕袚?dān)者，其對于維持細(xì)胞乃至生物體的正常生理功能至關(guān)重要。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約50%藥物的靶向分子為膜蛋白，特別是跨膜蛋白，它們占據(jù)了已知藥物靶點(diǎn)的很大比例。膜蛋白研究不僅有助于揭示疾病的發(fā)生機(jī)制，還能推動(dòng)生物學(xué)研究的深入。此外，研究人員還可以設(shè)計(jì)出具有特定功能的膜蛋白或基于膜蛋白的生物材料。這些新材料在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護(hù)、能源開發(fā)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，膜蛋白的研究至關(guān)重要。

然而，目前膜蛋白研究依舊面臨著困境。首先在生物體內(nèi)膜蛋白的表達(dá)量較低，其次，因膜蛋白自身具有高度疏水性，因此它在溶液中很容易形成聚集體，另外膜蛋白可能包含多個(gè)跨膜區(qū)域，糖基化修飾等等，且它在常規(guī)條件下難以維持正確的構(gòu)象。

傳統(tǒng)的基于細(xì)胞的膜蛋白表達(dá)通常會(huì)存在問題，比如：低產(chǎn)、細(xì)胞毒性、蛋白質(zhì)聚集以及錯(cuò)誤折疊等。而膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究也因?yàn)殡y以生產(chǎn)足夠數(shù)量的蛋白質(zhì)產(chǎn)品而受到嚴(yán)重阻礙。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)（CFPS）系統(tǒng)正被視為克服上述障礙的可行替代工具，因?yàn)樵贑FPS系統(tǒng)中幾乎不需要考慮細(xì)胞活力和蛋白表達(dá)過程，此外，該系統(tǒng)的開放性允許研究人員直接控制反應(yīng)條件，例如，添加輔助試劑，各種形式的脂質(zhì)、催化劑等等。

圖1:當(dāng)前膜蛋白的CFPS策略

相比于傳統(tǒng)的基于細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)來說，CFPS系統(tǒng)由于其與細(xì)胞活性解耦的特性，提供了一種更加快速高效的蛋白質(zhì)合成方案。而去垢劑在此過程中起到了關(guān)鍵作用，通過溶解膜蛋白并防止其聚集，從而去提高膜蛋白的可溶性和表達(dá)效率。

已有研究討論了去垢劑對體外表達(dá)的膜蛋白的影響，那些在產(chǎn)量和溶解度方面都成功的實(shí)驗(yàn)是使用臨界膠束濃度（CMC）相對較低的溫和去垢劑，而為了防止聚集體或不均勻的蛋白質(zhì)聚合物的形成，表達(dá)的蛋白質(zhì)和膠束之間的摩爾比不得高于1。通常是不建議使用具有相對高CMC的去垢劑，因?yàn)樗鼈儽仨氁韵喈?dāng)高的濃度存在，因此會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯。

體外膜蛋白重建的理想情況是在更類似于天然脂質(zhì)雙分子層的環(huán)境中工作。將膜蛋白重新構(gòu)建或直接插入到囊泡和脂質(zhì)體中，是CFPS系統(tǒng)中一種重要的策略，這有助于研究膜蛋白的功能和結(jié)構(gòu)。其中重新構(gòu)建策略有兩種，包括從沉淀物中重新構(gòu)建以及利用吸附劑顆粒。直接插入的策略也有兩種，包括在無細(xì)胞表達(dá)反應(yīng)中直接加入脂質(zhì)體（如DOPC、DMPC等）以及利用倒轉(zhuǎn)囊泡的方法。

通過重新構(gòu)建或直接插入囊泡和脂質(zhì)體的方法來實(shí)現(xiàn)更接近膜蛋白的天然環(huán)境，這將有助于保持膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，適用于功能研究和藥物傳遞等。然而脂質(zhì)體和囊泡的異質(zhì)性可能會(huì)影響結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，且高質(zhì)量的倒轉(zhuǎn)囊泡樣本難以制備，商業(yè)上也不易獲得。

為了克服使用微粒體和囊泡的局限性，最近提出了基于使用“納米生物"或“納米脂蛋白顆粒"（NLP）的新策略。它是一種納米級的盤狀顆粒，由兩親性螺旋蛋白（即支架蛋白）包裹在脂質(zhì)雙分子層的平面圓周上形成。NLPs的直徑取決于所使用的支架蛋白類型，通常在9～20納米之間，且分子質(zhì)量偏差非常小（<5%），這使得它們具有高度的單分散性。這種結(jié)構(gòu)為膜蛋白的表達(dá)和研究提供了理想的平臺。

NLPs通過其的結(jié)構(gòu)，能夠穩(wěn)定地包裹和呈現(xiàn)膜蛋白，有助于保持其天然構(gòu)象和功能。與微粒體和囊泡等傳統(tǒng)載體相比，NLPs具有更高的穩(wěn)定性和可控性，從而顯著提高了膜蛋白的表達(dá)效率和純度。此外，NLPs還具有高度的可定制性，可以通過選擇不同的支架蛋白（如載脂蛋白A1、E和C，以及昆蟲的脂磷蛋白等）來適應(yīng)不同類型的膜蛋白需求。

圖2:NLP存在下的無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)

1. 結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的挑戰(zhàn)與機(jī)遇

盡管CFPS技術(shù)在研究膜蛋白方面已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，部分膜蛋白結(jié)構(gòu)已通過X射線晶體學(xué)和固態(tài)核磁共振（NMR）技術(shù)得到解析，但在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域仍面臨重大挑戰(zhàn)。未來，需要更多地探索CFPS技術(shù)與結(jié)晶技術(shù)（如脂質(zhì)立方相結(jié)晶）之間的協(xié)同效應(yīng)，比如使用NLP（納米脂質(zhì)顆粒）-蛋白質(zhì)復(fù)合物而非去垢劑溶解的蛋白質(zhì)來填充立方相基質(zhì)，以期提高結(jié)構(gòu)解析的成功率和質(zhì)量。

2.多樣化表達(dá)策略

CFPS膜蛋白在產(chǎn)量、溶解度和蛋白質(zhì)質(zhì)量方面取得了顯著改進(jìn)。未來，這一領(lǐng)域的研究將繼續(xù)聚焦于優(yōu)化反應(yīng)條件，以較大化膜蛋白的產(chǎn)量，并改善其溶解性和功能活性，從而推動(dòng)下游應(yīng)用的發(fā)展。無細(xì)胞表達(dá)膜蛋白的策略多種多樣，包括在去垢劑存在下的表達(dá)、作為沉淀表達(dá)、在脂質(zhì)體或囊泡存在下的表達(dá)、使用NLPs的表達(dá)，以及與支架蛋白的共表達(dá)等等。每種策略都有其優(yōu)勢和局限性。未來的研究將進(jìn)一步開發(fā)和優(yōu)化這些策略，以適應(yīng)不同類型的膜蛋白和研究需求。

3.跨學(xué)科合作與技術(shù)創(chuàng)新

膜蛋白研究的復(fù)雜性要求跨學(xué)科的合作，包括生物化學(xué)、分子生物學(xué)、物理學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域。未來的研究將借助高通量篩選、機(jī)器學(xué)習(xí)等新技術(shù)，加速新方法的開發(fā)和應(yīng)用，以提高無細(xì)胞表達(dá)膜蛋白的效率和成功率。

隨著無細(xì)胞表達(dá)膜蛋白技術(shù)的不斷成熟，其應(yīng)用前景也將更加廣闊。在藥物研發(fā)、生物傳感器、生物能源、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域，膜蛋白都展現(xiàn)出巨大的潛力。未來，將更多地探索這些潛在應(yīng)用，推動(dòng)相關(guān)技術(shù)的轉(zhuǎn)化和商業(yè)化。

Manzer ZA, Selivanovitch E, Ostwalt AR, Daniel S. Membrane protein synthesis: no cells required. Trends Biochem Sci. 2023;48(7):642-654. doi:10.1016/j.tibs.2023.03.006